5.需要什么级别的引物?

答:引物常用的纯化方式C18脱盐,OPC纯化,PAGE纯化,HPLC纯化。根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。

应用 引物长度要求 纯度级别要求

一般PCR扩增 < 45base OPC

>45 base PAGE

诊断PCR扩增 < 40base OPC, PAGE

DNA测序 20base左右 OPC

亚克隆,点突变等 根据实验要求定 OPC, PAGEHPLC

基因构建(全基因合成) 根据实验要求定 PAGE

反义核酸 根据实验要求定 PAGE

修饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLC

6.最长可以合成多长的引物?

答:引物越长,出现问题的概率就越大。我们合成过120base的引物,但是产率很低。除非需要,建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率,80mer的粗产品,全长(还不一定正确)引物的百分比不会超过40%,后续处理还有丢失很多,最后的产量是很低。

7.需要合成多少OD数?

答:根据实验目的确定。一般PCR扩增,2 OD引物,可以做200-50050ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接,1 OD就足够了。但是有些研究人员,就做几次PCR,但是却要5-10 OD。做全基因构建的引物都比较长,但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长, 最后全长得率就越低,出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求,其实也是对社会资源的一种浪费,同时也从一个侧面反映了部分研究人员,特别是新手的自信心不足,总觉得需要重复多次才能成功。

8.如何检测引物的纯度?

答:实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的。如果条件许可,也可以用EB 染色或银染方式染色。

9.如何计算引物的浓度?

答:引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一致,请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。

一般情况下,我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul,加水的体积(微升)按下列方式计算:V (微升)= OD*(乘)33 *(乘)*(乘)20000 / () 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度,按上述公式换算。

注意:1 OD260= 33 ug/ml.

10.如何计算引物的Tm值?

答:引物设计软件都可以给出Tm,引物长度,碱基组成,引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物,Tm计算公式为:Tm = 4(G + C)+ 2(A + T)

对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为:

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size

公式中,Size = 引物长度。

Tm的定义:Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.